MICROBIOLOGY LABORATORY EXPERIMENTS AND PROCEDURE

The  cultural ‘microbial’ in milk

บทนำทั่วไป
             จุลินทรีย์ เจริญได้ดีในน้ำนมเพราะน้ำนมมีสารอาหารที่สมบูรณ์  มีความชื้น และความเป็น กรด-ด่างที่เหมาะสมต่อการเจริญของจุลินทรีย์ ทุกชนิด  แต่แบคทีเรียจะเจริญได้เร็วกว่าจุลินทรีย์ชนิดอื่น  การเสียของน้ำนมจึงมักมีสาเหตุจากแบคทีเรียมากกว่าจุลินทรีย์ชนิดอื่น จุลินทรีย์ที่ตรวจพบในน้ำนมอาจปนเปื้อนมาได้หลายทาง เช่น  จากสิ่งแวดล้อมภายในคอก จากภาชนะที่ใส่น้ำนม จากผู้รีดนมจากเครื่องรีดนม และจากการขนส่งน้ำนม เป็นต้น การมีจุลินทรีย์อยู่ในน้ำนมจะมีผลต่อกลิ่น รส อายุ การเก็บ การถนอม ความเหมาะสมต่อการนำไปผลิตผลิตภัณฑ์นมหรืออาหารอื่นๆ และความปลอดภัย ในการบริโภค น้ำนมที่คุณภาพดีนั้นควรมีจุลินทรีย์ปนเปื้อนมาน้อยที่สุดเท่าที่จะทำได้ เพราะฉะนั้น การตรวจหาปริมาณของจุลินทรีย์ในน้ำนมจึงเป็นก้าวสำคัญในการประเมินคุณภาพของน้ำนม

วัสดุและอุปกรณ์
1. น้ำนมตัวอย่าง ( น้ำนมดิบ น้ำนมพาสเจอไรซ์ )
2. Tryptone glucose yeast extract agar (B790/500g)หรือ( Plate Count Agar B298/500 g)
3. Methylene blue
4. Rezasurin
5. Xylol
6. ปิเปตที่ฆ่าเชื้อแล้ว
7. จานเพราะเชื้อที่ฆ่าเชื้อแล้ว
8. น้ำกลั่นที่ฆ่าเชื้อแล้วสำหรับเจอจางน้ำนม
9. สไลด์ที่สะอาด                  

วิธีปฏิบัติ
1.   การหาปริมาณของแบคทีเรียในน้ำนมโดยวิธีนับเซลล์ที่ยังมีชีวิตอยู่  (Viable count)        
1.1 นำน้ำนมตัวอย่างมาทำการเจือจางในน้ำกลั่นที่ปราศจากเชื้อให้มีความเจือจางเท่ากับ    10-1 10-2 10-3 10-4 10-5   ตามลำดับ
1.2 นำน้ำนมแต่ละความเจือจางในข้อ 1 ดูดใส่จานเพาะเชื้อ จานละ 1มิลลิลิตรแล้วเทอาหาร Tryptone glucose yeast extract agar (B790/500g) ที่หลอมเหลวและทิ้งให้มีอุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส แล้วเทลงในจานเพาะเชื้อประมาณ 15 มิลลิลิตร ขยับจานไปมาเพื่อให้ตัวอย่างน้ำนมผสมกับอาหารทั่วกันดี ปล่อยให้อาหารแข็ง ทำซ้ำ 2 ชุด
1.3 บ่มที่อุณหภูมิห้องนาน 48 ชั่วโมง ตรวจนับจำนวนโคโลนีทั้งหมดแล้วคำนวณออกมาเป็นจำนวนต่อ 1 มิลลิลิตร ของน้ำนม
2.  การหาปริมาณของจุลินทรีย์ในน้ำนมโดยวิธีการนับโดยตรง  ( Direct count)
2.1 ขดลวดเขี่ยเชื้อให้เส้นลวดกลมสม่ำเสมอและมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 4-5 มิลลิเมตร
2.2  เขย่าตัวอย่างน้ำนม แล้วใช้ลวดเขี่ยเชื้อตักน้ำนมมา 1 ห่วงหรือ 1 ลูปนำไปแผ่กระจายบนสไลด์ให้สม่ำเสมอในเนื้อที่ 1 ตารางเซนติเมตร ทิ้งไว้ให้แห้ง
2.3  ย้อมสีโดยการหยด Xylol ให้ท่วมบริเวณที่แผ่น้ำนมไว้ทิ้งไว้ 1 นาที แล้วเท Xylol  ทิ้งไป ปล่อยสไลด์ให้แห้ง หยดแอลกอฮอล์ให้ท่วมที่บริเวณเดิมทิ้งไว้ 1 นาที  แล้วเททิ้ง ปล่อยให้สไลด์แห้ง  หยดสี methylene blue ลงที่บริเวณเดิม ทิ้งไว้ 3 นาที  ล้างน้ำ ทิ้งไว้ให้แห้ง แล้วนำไปศึกษาจุลินทรีย์ด้วยกล้องจุลทรรศน์
2.4 นับจำนวนเซลล์ของจุลินทรีย์ที่ปรากฏในฟิลด์ ( field) แต่ละฟิลด์ นับจำนวน 30 ฟิลด์ แล้วหาค่าเฉลี่ยของจำนวนจุลินทรีย์ต่อ 1 ฟิลด์
2.5 นำค่าเฉลี่ยของจำนวนจุลินทรีย์ต่อ 1 ฟิลด์มาคูณด้วยค่า 500,000 ผลที่ได้จะเป็นประมาณ จุลินทรีย์ต่อน้ำนม 1  มิลลิลิตร โดยประมาณ (ค่า 500,000 ที่นำมาคูณเป็นผลที่ได้จากการคำนวณว่า พื้นที่ 1 ฟิลด์ ในกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้ Oil immersion objective lens จะเท่ากับ1/5000  ตารางเซนติเมตร และน้ำนม 1 ห่วงจะมีปริมาตรประมาณ 0.01 มิลลิลิตร )
3. การตรวจคุณภาพของน้ำนมโดยวิธี  Reduction test
3.1    ดูดสี resazurin 1 มิลลิลิตร ใส่หลอดทดลองที่มีน้ำนมอยู่ 10 มิลลิลิตรแล้ว แช่หลอดในอ่างน้ำที่มีอุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง
3.2 อ่านผลโดยดูการเปลี่ยนสีของ resazurin ว่าเปลี่ยนเป็นสีอะไรแล้วรายงานคุณภาพของน้ำนมเป็นเกรดดังต่อไปนี้
                            สีม่วง  คุณภาพเป็นเกรด       1     สีลาเวลเดอร์   คุณภาพเป็นเกรด       2
                            สีชมพู คุณภาพเป็นเกรด       3    สีขาว              คุณภาพเป็นเกรด      4

****หมายเหตุ  บทความนี้ไม่สามารถใช้อ้างอิงเชิงวิชาการ****
***บริษัทฯใคร่ขอขอบพระคุณอาจารย์ สุมาลี  เหลืองสกุล     จุลชีววิทยาทางอาหาร     ผู้เป็นเจ้าของลิขสิทธิ์หนังสือและเราไม่มีเจตนาจะแสวงหาประโยชน์อื่นนอกจากให้ผู้ใช้เกิดประโยชน์ในการเลือกใช้สินค้าเท่านั้น
***บริษัทฯขอสงวนสิทธิ์ในการเปลี่ยนแปลง แก้ไขเพิ่มเติม เพื่อความสะดวกในการศึกษา****
บรรณานุกรม
สุมาลี  เหลืองสกุล  2539   จุลชีววิทยาทางอาหาร    ฉบับปรับปรุงใหม่ โรงพิมพ์ชัยเจริญ กรุงเทพฯ
Barnett, H.L. 1955. Illustrated Genera of Imperfect Fungi. Burgess, Minneapolis. Collins, C.H.;P.M, Lyne. And J.M Grange. 1995.
            Microbiology. Difco Laboratories incorporated Detroid Michigan . USA.  DiLiello, L.R 1982. Methods in Food and Dairy Microbiology. AVI Publishing Company, Inc
Principle and Specific Application. Oxford: Blackwell Scientific  Publications. Johnson, T.R.; C.L. Case.1989.  Laboratory Experiments in Microbiology. Brief ed., Second ed. The benjamin/ Cummings Publishing Company. Inc. New York.