The cultural ‘Coliform’ in water and foods

บทนำทั่วไป
การตรวจจุลินทรีย์ก่อโรคหลายชนิดในอาหาร  บางครั้งทำได้ไม่สะดวก  ต้องใช้อาหารพิเศษและค่อนข้างยุ่งยาก หรือมีจำนวนน้อยเกินไปในอาหารจนทำให้ตรวจไม่พบ การเพาะเลี้ยงเชื้อโรคในห้องปฏิบัติการอาจทำให้เจ้าหน้าที่เสี่ยงต่อการติดโรคเพิ่มขึ้น หรือต้องใช้เวลาในการเพาะเลี้ยงเชื้อตลอดจนการวิเคราะห์เชื้อในบางครั้งทำได้ลำบากจึงมีการใช้แบคทีเรียกลุ่มหนึ่งเป็นดัชนีในการบอกถึงการปนเปื้อนกับสิ่งปฏิกูล      หรือบอกให้ทราบถึงลักษณะการสุขาภิบาลของการผลิตอาหารนั้นๆ แบคทีเรียกลุ่มดังกล่าว คือ แบคทีเรียโคลิฟอร์ม ซึ่งหากตรวจพบในอาหารจะชี้ให้เห็นว่าอาจมีแบคทีเรียในสำไส้หรือจุลินทรีย์อื่นๆที่เป็นพิษปนเปื้อนเข้าไปในอาหารได้    การตรวจแบคทีเรียโคลิฟอร์มจะทำได้ง่ายกว่าการตรวจเชื้อก่อโรคและสามารถทำในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาทั่วไปได้
แบคทีเรียลิฟอร์มเป็นแบคทีเรียรูปท่อนสั้น ไม่สร้างสปอร์ ย้อมติดสีแกรมลบ เป็นพวกต้องการ
ออกซิเจนหรือไม่ต้องการก็ได้   หมักย่อยน้ำตาลแล็กโทสแล้วให้กรดกับก๊าซที่อุณหภูมิ 35-37 องศาเซลเซียส   
ภายใน 24-48 ชั่วโมง   แบคทีเรียโคลิฟอร์มชนิดที่สำคัญ ได้แก่Escherichia coli   ( fecal type ) และ Enterobacter aerogenes ( non fecal type)
การตรวจแบคทีเรียโคลฟอร์มอาจตรวจโดยวิธี  Coliform test  ซึ่งเป็นการตรวจหาเชื้อโดยตรง หรือใช้วิธีประเมินค่าทางสถิติที่เรียกว่า  most probable number (MPN)ก็ได้

วัสดุและอุปกรณ์
1. ตัวอย่างน้ำ/อาหาร
2. Lactose broth(B316/500 g) พร้อมหลอดดักก๊าซ
3. Eosin methylene blue agar (B180/500g)
4. Brilliant Green bile broth 2 % (BGB) (B015/500g) ที่มีความเข้มข้นเป็น  2 เท่าของสูตรปกติ
5. Brilliant Green bile broth (BGB)(B015/500 g)  ที่มีสูตรความเข้มข้นเป็นปกติ
6. ปิเปตที่ฆ่าเชื้อแล้ว
7. จานเพาะเชื้อที่ฆ่าเชื้อแล้ว
8. น้ำกลั่นหรือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่ปราศจากเชื้อสำหรับเจือจางอาหาร
9. ชุดย้อมสีแกรม (Gram’s Iodine BA027/100 ml,Gram’s Safranin BA028/100 ml,Gram’s Crystal violet  BA087/100 ml)

วิธีปฏิบัติ
การตรวจสอบหาแบคทีเรียโคลิฟอร์มโดยวิธี  Coliform test
1. การเตรียมตัวอย่างน้ำ/อาหาร เจือจางตัวอย่างน้ำ 10 มิลลิลิตร/อาหาร 10 กรัมในฟอสเฟตบัฟเฟอร์
หรือน้ำกลั่นที่ปราศจากเชื้อ 90 มิลลิลิตร เขย่าให้เข้ากันดี เป็นน้ำหรืออาหารที่มีความเจือจางเป็น 10-1
2. การตรวจแบ่งออกเป็น 3 ขั้นตอน คือ
2.1 Presumptive test  ดูดน้ำ/อาหารที่มีความเจือจางเป็น  10-1  ใส่ในLactose broth(B316/500 g) ที่เติม bronthymol  bule และมีหลอดดักก๊าซอยู่หลอดละ 1 มิลลิลิตรจำนวน 2หลอด บ่มไว้ที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส นาน48 ชั่วโมง ตรวจผลโดยการดูหลอดที่เกิดกรดและก๊าซ   ถือว่าการทดสอบได้ผลบวก
2.2  Confirm test เลือกหลอดที่ให้ผลบวกในข้อ 2.1  มา Streak ลงบน  Eosin methylene blue agar (B180/500g) บ่มไว้ที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส นาน 18-24 ชั่วโมง สังเกตโคโลนีของ  Escherichia coli ซึ่งเป็นสีเขียวเป็นมันวาวเหมือนรอยตัดของโลหะ (Metallic sheen)และโคโลนีของ Enterobacter aergenes  ซึ่งมีโคโลนีสีม่วง ตรงกลางมีสีเข้ม และโคโลนีมีลักษณะใหญ่ยิ้ม
2.3 Complete test นำโคโลนีมีลักษณะตามต้องการมาเพาะในLactose broth(B316/500g)   อีกครั้งหนึ่ง บ่มที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส นาน 48 ชั่วโมง ถ้าเกิดกรดและก๊าซอีกให้นำมาย้อม สีแกรมถ้าได้แบคทีเรียที่มีรูปท่อนสั้นติดสีแกรมลบถือว่าการทดสอบให้ผลบวก แสดงว่าตัวอย่าง น้ำ/อาหารนั้นมีแบคทีเรียโคลิฟอร์มปนเปื้อนอยู่

การตรวจหาแบคทีเรียโคลิฟอร์มโดยวิธี MPN
1. เติมตัวอย่างน้ำ/อาหารเหลว 10 มิลลิลิตร ลงในหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อแต่ละหลอดที่ บรรจุBrilliant Green bile broth 2 % (BGB) (B015/500g) ที่มีความเข้มข้นเป็น 2 เท่าของสูตรปกติ 10 มิลลิลิตร พร้อมหลอดดักก๊าซ จำนวน 5 หลอด และเติมตัวอย่าง 1 มิลลิลิตร และ0.1 มิลลิลิตร ลงในหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อแต่ละหลอดที่บรรจุ Brilliant Green bile broth (BGB) (B015/500g)ที่มีความเข้มข้นตามสูตรปกติ 10 มิลลิลิตรพร้อมหลอดดักก๊าซ อย่างละ 1 หลอด ตามลำดับ
2.บ่มไว้ที่อุณหภูมิ 32 องศาเซลเซียส นาน 24-48 ชั่วโมง
3. สังเกตหลอดที่มีก๊าซไปแทนที่ BGBในหลอดดักก๊าซประมาณ10 % ถือว่าให้ผลบวก
4. นำผลของจำนวนหลอดที่ให้บวกทั้ง 3 ความเจือจางไปเทียบค่า MPN ในตาราง จะได้ค่า MPN/100 มิลลิลิตร

****หมายเหตุ  บทความนี้ไม่สามารถใช้อ้างอิงเชิงวิชาการ****
***บริษัทฯใคร่ขอขอบพระคุณอาจารย์ สุมาลี  เหลืองสกุล     จุลชีววิทยาทางอาหาร     ผู้เป็นเจ้าของลิขสิทธิ์หนังสือและเราไม่มีเจตนาจะแสวงหาประโยชน์อื่นนอกจากให้ผู้ใช้เกิดประโยชน์ในการเลือกใช้สินค้าเท่านั้น
***บริษัทฯขอสงวนสิทธิ์ในการเปลี่ยนแปลง แก้ไขเพิ่มเติม เพื่อความสะดวกในการศึกษา****
บรรณานุกรม
สุมาลี  เหลืองสกุล  2539   จุลชีววิทยาทางอาหาร    ฉบับปรับปรุงใหม่ โรงพิมพ์ชัยเจริญ กรุงเทพฯ Barnett, H.L. 1955. Illustrated Genera of Imperfect Fungi. Burgess, Minneapolis. Collins, C.H.;P.M, Lyne. And J.M Grange. 1995.
            Microbiology. Difco Laboratories incorporated Detroid Michigan . USA.  DiLiello, L.R 1982. Methods in Food and Dairy Microbiology. AVI Publishing Company, Inc
Principle and Specific Application. Oxford: Blackwell Scientific  Publications. Johnson, T.R.; C.L. Case.1989.  Laboratory Experiments in Microbiology. Brief ed., Second ed. The benjamin/ Cummings Publishing Company. Inc. New York.